Polimerazės grandininė reakcija yra molekulinės biologijos procedūra, kuri dubliuoja sekcijas iš genetinės medžiagos (Deoksiribonukleorūgštis, DNR). Milijonai vienodų kopijų gaminami iš nedidelio kiekio DNR. Tokiu būdu yra prieinami kiekiai, kurių pakanka įvairiems tyrimams.
Kas yra polimerazės grandininė reakcija?
Polimerazės grandininė reakcija yra molekulinės biologijos metodas, kuris dubliuoja genetinės medžiagos pjūvius (Deoksiribonukleorūgštis, DNR). Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) terminas apibūdina in vitro (lot. Stikle) reakciją pasitelkiant fermentą polimerazę (DNR polimerazę), dėl kurios tam tikros genas sekos. Reakcijos produktas taip pat yra pradinė medžiaga naujam šios reakcijos ciklui. Skaičius molekulės dvigubai ir tuo pačiu metu tarnauja kaip naujo ciklo šablonas. Tai vadinama eksponentiniu dauginimu. Tai vyksta laboratorijoje dideliu kelių minučių greičiu, panašiu į grandininę reakciją. Šis laboratorinis procesas imituoja genetinės informacijos (DNR) dubliavimąsi, kuris vyksta natūraliomis sąlygomis replikacijos metu. Amerikos chemikas KB Mullis laikomas šio proceso atradėju. 1983 m. Jis pristatė šį DNR sintezės procesą ir po dešimties metų buvo apdovanotas Nobelio chemijos premija.
Funkcija, poveikis ir tikslai
Gyvuose organizmuose esanti DNR chromosomų kurio ilgis negali būti padidintas naudojant PGR. Vietoj to jis naudojamas apibrėžtam skyriui sustiprinti. Tai gali būti genai, specifinė a dalis genasarba regionai, į kuriuos neperrašyta baltymai, ty yra nekoduojami. Šiuos skyrius paprastai sudaro ne daugiau kaip trys tūkstančiai bazių porų, palyginti su maždaug du milijardais bazinių porų kiekviename rinkinyje chromosomų žmonėms. Polimerazės grandininei reakcijai reikalinga vienos arba dviejų grandžių DNR grandinė, kurios struktūra turi būti bent iš dalies žinoma. Be fermento, polimerazės, naudojami du pradmenys. Tai yra DNR statybiniai blokai, kurie veikia kaip pradinis ir galinis taškai. Jiems būdinga seka, tiksliai atitinkanti stiprintiną regioną. Laboratorijoje polimerazės grandininė reakcija vykdoma programuojamame kaitinimo bloke. Būtini komponentai, tokie kaip polimerazė, gruntas, statybinės medžiagos naujosios grandinės statybai (dezoksiribonukleozidų trifosfatai) ir Magnis jonai pridedami buferiniame tirpale. Reakcijos temperatūros ir laiko programa prasideda nuo denatūracijos esant aukštesnei nei 94 ° C temperatūrai. Šiame procese dvipusė DNR yra skaidoma ir yra vienos grandinės forma. Kitame etape, esant maždaug 70 ° C temperatūrai, gruntas surišamas su genas seka ir sudaro atspirties tašką fermento reakcijai. Iš čia polimerazė sintetina papildomą grandinę. Tada prasideda naujas ciklas, kuris vėl susideda iš trijų denatūravimo, pradmenų surišimo ir DNR grandinės sintezės etapų. Polimerazės grandininė reakcija naudojama teismo medicinoje, klinikinėje diagnostikoje ir klinikiniuose tyrimuose. Teismo ekspertizėje DNR yra išgaunama iš oda, seilės, plaukai, sperma arba kraujas iš nusikaltimo vietų ir po sustiprinimo lyginamas su žinomais pavyzdžiais ir naudojamas konkretiems asmenims identifikuoti. Naudojant šį genetinį piršto atspaudą, tėvystę taip pat galima išaiškinti taikant modifikuotą metodą. Išaiškinant ligas, polimerazės grandininė reakcija naudojama norint patikrinti susijusius genus. Kai kurias bakterines ligas galima klasifikuoti atpažįstant specifines sekas. Virusinės ligos gali būti apibūdinamos, kai viruso DNR ar RNR yra transformuojama ir sustiprinama. Į kraujas atranką, galima aptikti hepatito ar ŽIV sukeltos ligos labai ankstyvoje stadijoje. Naviko diagnostikoje jis naudojamas naviko ląstelėms nustatyti. Tai leidžia klasifikuoti naviką, įvertinti ligos eigą, sėkmę terapija ir prognozė. Tyrimų metu polimerazės grandininė reakcija naudojama genams, susijusiems su įvairiomis ligomis, nustatyti. Genų klonavimui, kuris nėra tas pats, kas organizmo klonavimas, genas sustiprinamas prieš perkeliant jį į kitus organizmus vektoriuje (lotynų kalba: keliautojas, nešėjas ). Tai gali būti pavyzdys, norint geriau ištirti ligą ar gaminti baltymai kad galima naudoti kaip narkotikai.
Rizika ir pavojai
Polimerazės grandininė reakcija turi didžiulį potencialą nustatyti nedidelius DNR kiekius. Norint pasinaudoti daugybe galimybių ir apsisaugoti nuo reikšmingų klaidų, reikia atsižvelgti į tam tikras išankstines sąlygas ir įvairius klaidų šaltinius. Galima sustiprinti tik tuos genetinės medžiagos skyrius, kurių seka yra bent iš dalies žinoma. Šiuo metodu neįmanoma sustiprinti visiškai nežinomų sekų. Vėliau amplifikacijos produktus galima vizualizuoti. Jei laukiamo signalo nematyti, nors ieškoma seka buvo, yra klaidingai neigiamas rezultatas. Dažniausiai tai yra neoptimizuotų ar blogai optimizuotų reakcijos sąlygų rezultatas. Tai turi būti nustatyta kaip tikslinės sekos funkcija. Šiuo tikslu bandomi skirtingi temperatūros ir laiko profiliai, pradmenų sekos ir kiekiai, taip pat kitų medžiagų koncentracijos reakcijos mišinyje. Klaidingai teigiami rezultatai rodomi kaip signalai, kurių negalima priskirti norimam produktui. Didžiausias problemas sukelia užteršimas DNR, gautas iš tyrėjo arba iš šaltinio, kuris nėra analizuojamas. Bakterinės kilmės DNR taip pat turi įtakos polimerazės grandininės reakcijos rezultatui. Mūvint pirštines ir labai atsargiai, tokių klaidų galima išvengti ir suformuluoti patikimas išvadas apie sustiprintus produktus.
