Kas yra PGR testas?
PGR tyrimas yra laboratorinis metodas, naudojamas molekulinėje biologijoje ir medicinoje. Testas naudojamas tiesioginiam genetinės medžiagos aptikimui ir apibūdinimui. Ekspertai mano, kad PGR metodas yra lengvas, universalus ir tvirtas.
Laboratorijoje PGR tyrimas susideda iš dviejų etapų. Pirmajame etape esama genetinė medžiaga amplifikuojama naudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR). Tai leidžia ištirti mažiausius DNR pėdsakus. Tai taip pat yra priežastis, kodėl PGR testai reaguoja taip jautriai.
Antrame etape genetinė medžiaga atskiriama pagal jos savybes, „rūšiuojama“ ir taip charakterizuojama. Kitaip tariant, nustatoma smulkioji DNR struktūra.
Yra daug galimų pritaikymų: gydytojai naudoja PGR testą, pavyzdžiui, tirdami tamponus, ar nėra koronaviruso, duodami kraują dėl ŽIV arba tikrindami naujagimius dėl galimų paveldimų ligų. Bakterinės infekcijos – pavyzdžiui, su tuberkuliozės sukėlėju – arba parazitinės infekcijos (maliarija) taip pat gali būti išaiškintos naudojant PGR.
Jie taip pat padeda nuteisti nusikaltėlius teismo medicinoje pagal jų genetinius pirštų atspaudus arba yra naudojami kaip tėvystės testai.
Kiek laiko galioja PGR testas?
PGR tyrimo rezultatas paprastai galioja 48 valandas nuo mėginio paėmimo.
Kiek patikimas yra PGR testas?
PGR yra išbandytas ir patikrintas aptikimo metodas molekulinėje diagnostikoje ir medicinoje. Jis laikomas vadinamuoju aukso standartu su labai mažu klaidų lygiu. Testams ypač būdingas labai didelis jautrumas ir specifiškumas.
Jautrumas – tai patikimumas, kuriuo atliekant tyrimą randama aptiktina genetinė medžiaga.
Specifiškumas – tai tikrumas, kuriuo atliekant tyrimą nustatoma, kad mėginyje nėra atitinkamos genetinės medžiagos.
Kada veikia PGR testai dėl Sars-CoV-2 infekcijos?
Paprastai PGR testas aptinka korona infekciją dvi ar tris dienas prieš ir iki 20 dienų po simptomų atsiradimo. Net užsikrėtusiems žmonėms, kuriems simptomai visiškai nejaučiami, testas yra veiksmingas kritiniu laikotarpiu, kai jie gali užkrėsti kitus.
Atskirais atvejais aptikti galima net po 60 dienų nuo simptomų atsiradimo.
Galimi klaidų šaltiniai
Praktiškai klaidų lygis DNR kopijavimo procese yra nereikšmingas. Nors DNR polimerazės niekada nėra be klaidų, jos vargu ar vaidina vaidmenį atliekant PGR tyrimo procedūrą.
Praktikoje galimi klaidų šaltiniai labiau slypi imant mėginius: todėl svarbu, kad tamponus atliktų apmokyti medicinos specialistai. Seilių ir skalavimo mėginiai gali sumažinti tyrimo tikslumą, nes čia atsiranda praskiedimo poveikis.
Kaip veikia PGR testas?
PGR tyrimą atlieka, pavyzdžiui, šeimos gydytojas arba specialiuose tyrimų centruose. Pirmiausia gydytojai arba apmokyti medicinos specialistai paima mėginį. Tyrimui dažniausiai paimamas tepinukas iš viršutinių kvėpavimo takų. Paprastai tai yra burnos arba nosiaryklės tepinėlis.
Galimas ir gargaliavimas skalavimo tirpalu. Kraujo mėginys yra netipinis koronarinei aptikimui, bet plačiai naudojamas, pavyzdžiui, naujagimių patikrai.
Nepriklausomai nuo paimto mėginio tipo, genetinė medžiaga randama ant medvilnės tampono, skalavimo tirpale arba kraujo laše. Ši mėginio medžiaga siunčiama į laboratoriją, kur ji išskiriama ir išgryninama.
Tada PGR testas yra padalintas į du etapus:
- PGR: Šiame etape padidinamas pradinės genetinės medžiagos kiekis.
1 žingsnis: PGR – „polimerazės grandininė reakcija“
„PGR“ yra pirmasis iš dviejų žingsnių: čia amplifikuojamas turimos pradinės DNR kiekis. Taip yra todėl, kad genetinę medžiagą galima analizuoti tik tada, kai jos turima pakankamai. Daugeliu atvejų tai yra žmogaus DNR; koronaviruso tyrimų atveju tai yra virusinė RNR.
Santrumpa PCR reiškia „polimerazės grandininę reakciją“.
Ko reikia PGR?
Pradinė DNR dedama į reakcijos indą su specialiomis medžiagomis. Esama genetinė medžiaga tarnauja kaip šablonas, kuris kopijuojamas esant tam tikriems fermentams (Taq polimerazei) ir tam tikriems pagrindiniams DNR statybiniams blokams.
Kopijavimo procesas vyksta keliais pasikartojančiais paleidimais (ciklais).
Konkrečiai, pridedamos šios medžiagos:
- Pradinė DNR: mėginio medžiaga, kurią reikia nukopijuoti.
- Pagrindiniai DNR statybiniai blokai: tai nukleobazės adeninas, timinas, citozinas ir guaninas.
- DNR polimerazė: fermentas, jungiantis atskirus DNR blokus, kad sudarytų tiksliai apibrėžtą DNR grandinę. Naujai gauta kryptis yra veidrodinis pirminės pradinės medžiagos vaizdas (papildomas).
- Pradmenys: jie susideda iš 16–24 bazinių porų ir yra pradinė padėtis bei pradžios signalas. Pradmenys parodo DNR polimerazę, kurioje (pradinės DNR) vietoje prasideda kopijavimo procesas.
Kaip atliekamas PGR tyrimas?
Dabar, kai reakcijos inde yra visos PGR reikalingos medžiagos, gali prasidėti tikrasis genetinės medžiagos kopijavimo procesas. Tai paleidžiama, valdoma ir vėl sustabdoma tik dėl temperatūros.
Todėl reakcijos indas vienas po kito kaitinamas arba atšaldomas iki skirtingų temperatūrų. Tai atliekama naudojant specialų įrenginį, vadinamą terminiu cikleriu. Visa reakcija trunka apie vieną ar dvi valandas.
Atskiri PGR ciklo etapai yra
- DNR dvigubų grandžių denatūravimas: mėginys kaitinamas iki maždaug 90 laipsnių Celsijaus. Tai išskiria pradinę DNR dvigubą grandinę į dvi atskiras (papildomas) viengubas.
- Gruntų tvirtinimas: Temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemiau 60 laipsnių Celsijaus. Dėl to pradmenys (priekinis pradmuo, atvirkštinis pradmuo) prisitvirtina prie atitinkamų atskirų DNR grandžių nustatytų vietų.
Pasibaigus ciklui, temperatūra vėl pakeliama iki maždaug 90 laipsnių Celsijaus – ciklas vėl prasideda nuo pradžių.
PGR metodas gali būti naudojamas amplifikuoti iki maždaug trijų kilobazių porų (kbp) DNR sekas. Tai atitinka maždaug 3,000 pagrindinių DNR statybinių blokų, sujungtų kartu, kad sudarytų „grandinę“. Palyginimui: žmogaus genomas saugo ląstelės veikimo brėžinius ir informaciją apie tris milijardus bazinių porų – koronaviruso genomą, kita vertus, sudaro 30,000 XNUMX bazinių porų. Todėl PGR testas gali amplifikuoti ir ištirti tik trumpas visos DNR dalis.
Gruntai yra labai svarbūs
Pradmenų pasirinkimas yra labai svarbus PGR procedūrai. Pavyzdžiui, Sars-CoV-2 diagnostikoje naudojami keli pradmenys (multiplex PCR).
Taigi Corona PGR testai ieško trijų skirtingų viruso genų: tai padidina bendrą specifiškumą iki beveik 99.99%. Tai reiškia, kad esant tokiam aukštam atitikčių rodikliui, iš 10,000 XNUMX tyrimų yra tik vienas klaidingai teigiamas testas (jei mėginiai paimti teisingai).
Kiek nukopijuotos genetinės medžiagos dabar yra?
Tarkime, kad po pirmojo ciklo yra dvi identiškos DNR dvigubos grandinės.
Po kiekvieno ciklo (nukopijuotos) genetinės medžiagos kiekis padvigubėja. Todėl DNR kiekis auga eksponentiškai.
Gydytojai paprastai pakartoja šį procesą maždaug dvidešimt ar trisdešimt kartų.
Vaizdžiai tariant, tai reiškia, kad net jei mėginyje pradžioje randama tik viena DNR dviguba grandinė, po dvidešimties ciklų reakcijos inde jau yra milijonas identiškų kopijų.
Ką reiškia Ct reikšmė?
Vykdomų PGR ciklų skaičius nurodomas vadinamosios Ct vertės forma. „Ct“ yra kilęs iš anglų kalbos termino „cycle threshold“. Ši Ct reikšmė leidžia daryti teiginius apie ieškomos genetinės medžiagos kiekį.
Esant mažai Ct vertei 20, yra daug pradinės genetinės medžiagos. Tačiau jei Ct vertė yra didelė – maždaug 30 ciklų – DNR yra atitinkamai mažai. Todėl PGR ciklas turi būti vykdomas dažniau.
2 veiksmas: elektroforezė „Rūšiavimas pagal dydį“
Kai yra pakankamai „sodrintos“ genetinės medžiagos, galima atlikti elektroforezę. Šiame procese mokslininkai išnaudoja specifinę DNR savybę: jos elektrinį krūvį.
Atskiri DNR blokai yra sujungti vienas su kitu per (neigiamai) įkrautą cukraus-fosfato pagrindą. Kuo ilgesnė tam tikra DNR seka, tuo didesnis jos elektrinis krūvis.
Tai leidžia ištirti ir apibūdinti genetinę medžiagą. Praktikoje nežinomas pavyzdys paprastai brėžiamas pagal žinomą atskaitą „pradžioje“ ir lyginamas vienas su kitu po tam tikro laiko.
Jei abiejų sekų „migracijos greitis“ yra vienodas, tai reiškia, kad aptikimas greičiausiai yra teigiamas: labai tikėtina, kad aptikimas teigiamas – jūsų ieškomas genas yra mėginyje.
Ypatingas koronaviruso atvejis: mėginio paruošimas ir RT-PGR
Koronaviruso aptikimas yra ypatingas atvejis. Sars-CoV-2 yra vienas iš vadinamųjų RNR virusų. Tai reiškia, kad Sars-CoV-2 genetinė medžiaga yra RNR (ribonukleino rūgšties) pavidalu.
RNR nuo DNR skiriasi tik keliais aspektais. Be kitų dalykų, jis yra kaip viena grandinė ir yra pagrįstas cukraus riboze, o ne 2′-dezoksiriboze. Nukleobazė timinas taip pat pakeičiamas uracilu kaip ketvirta baze.
Ši virusinė RNR turi būti „transkribuota“ į DNR prieš įprastą PGR tyrimą. Šis procesas vadinamas atvirkštine transkripcija (RT) – taigi ir terminas RT-PGR. Šio proceso metu gaunama viena cDNR grandinė („komplementari DNR“). Kitame žingsnyje cDNR viena grandis yra papildyta antrąja veidrodinio vaizdo DNR grandine.
Kiek laiko užtrunka norint gauti rezultatą?
Kai mėginys bus išsiųstas į laboratoriją, rezultatą paprastai gausite per vieną ar dvi darbo dienas. Bandymų centruose, kuriuose mėginiai dažnai tiriami tiesiogiai vietoje, tai taip pat gali užtrukti vos kelias valandas. Laiko tarpas labai priklauso nuo atitinkamo bandymų centro ir jo logistikos.
Nepaisant sudėtingų darbo procesų, šiuolaikinės laboratorijos gali atlikti PGR tyrimus dideliu našumu. Testus atlikti padeda specialūs automatizuoti įrenginiai.
Nepaisant to, PGR testas laikomas palyginti „lėtu“, bet juo labiau patikimu aptikimo metodu.
Kas atsitiks, jei rezultatas bus teigiamas?
Jei mėginys paimtas teisingai, teigiamas PGR testas reiškia, kad yra labai didelė tikimybė, kad tiriamasis yra užsikrėtęs Sars-CoV-2.
Jei PGR testu buvo patvirtintas jūsų užsikrėtimas koronavirusu, visuomenės sveikatos skyrius gaus pranešimą apie teigiamą tyrimo rezultatą iš atitinkamos laboratorijos. Tokiu atveju visuomenės sveikatos skyrius skirs izoliaciją arba karantiną.
Ar aš automatiškai užkrečiamas, jei PGR testas teigiamas?
Paprastai taip. Bet ne visada. PGR tyrimo rezultatas visada turi būti interpretuojamas atsižvelgiant į kontekstą. Teigiamas testas visų pirma reiškia, kad nešiojate virusinę medžiagą.
Kartais naudingas papildomas antikūnų tyrimas
Tokiais atvejais antikūnų tyrimas suteikia tikrumo, patvirtinančio PGR tyrimo pagrįstumą. Geriausia tai aptarti su gydytoju. Jie gali padėti teisingai interpretuoti PGR tyrimo rezultatą.
Ką daryti, jei rezultatas yra neigiamas?
Neigiamas PGR tyrimo rezultatas greičiausiai reiškia, kad mėginio paėmimo metu nesirgote Covid-19, todėl šiuo metu nesate užkrečiamas. Tačiau galite būti ankstyvoje infekcijos fazėje.
Koroninės infekcijos dažniausiai gali būti aptiktos tik antrą ar trečią dieną po užsikrėtimo. Todėl rezultatas nėra nemokamas leidimas. Todėl turėtumėte ir toliau laikytis socialinio atsiribojimo bei higienos taisyklių ir toliau dėvėti FFP2 kaukę – savo ir kitų apsaugai.
PGR testas vaikams
PGR testas vaikams nesiskiria nuo PGR tyrimo suaugusiems. Tiek mėginių ėmimas, tiek rezultatų interpretavimas galioja ir vaikams, ir suaugusiems.
Kokia yra PGR tyrimo rizika?
PGR testas nekelia jokios fizinės rizikos. Tik mėginio paėmimas nosiaryklės tamponu kai kuriems žmonėms yra nerimą keliantis ar nemalonus.
Kiek kainuoja PGR tyrimas?
Atkreipkite dėmesį: jei pasitikrinote save namuose ir gavote teigiamą rezultatą, nedelsdami kreipkitės į savo šeimos gydytoją telefonu. Gydytojas aptars su jumis tolesnius veiksmus telefonu.
Arba geriausia skambinti telefonu 116 117 ir užsiregistruoti PGR tyrimui. Idealiu atveju turėtumėte likti namuose iki patvirtinimo testo, kad apsaugotumėte save ir kitus.
