Patch-clamp technika vadinama elektrofiziologine matavimo technika. Tai leidžia matuoti jonines sroves atskirais kanalais plazmos membranoje.
Kas yra pleistro-spaustuko technika?
Pleistrinio spaustuko technika arba pleistro spaustuko metodas priklauso elektrofiziologijai, kuri yra neurofiziologijos šaka, susijusi su elektrocheminiu signalų perdavimu nervų sistema. Taikant šį metodą galima vizualizuoti atskirus jonų kanalus ląstelės membrana kūno ląstelės. Tai apima kelių pikoamperų srovių matavimą. Pleistravimo-spaustuko techniką pirmą kartą 1976 m. Aprašė vokiečių biofizikas Erwinas Neheris ir vokiečių gydytojas Bertas Sakmannas. Abiem mokslininkams 1991 metais buvo paskirta Nobelio fiziologijos ar medicinos premija už užveržimo-pleistro technikos plėtrą. Taigi elektrofiziologinius tyrimus iš esmės pakeitė pleistro-spaustuko technika, nes tai atvėrė galimybę stebėti elektrinį elgesį prie membranos baltymai asmens molekulės. Terminas pleistras kilęs iš anglų kalbos ir reiškia „pleistras“. Tai reiškia mažą membranos dalį po pleistro pipete, kuri naudojama kaip matavimo elektrodas. Matavimo proceso metu membranos pleistras tvirtinamas arba tvirtinamas (norint prispausti) prie nurodytų potencialų.
Funkcija, poveikis ir tikslai
Patch-clamp technika yra elektrofiziologinės analizės metodas. Tai pagrįsta biologiniu faktu, kad ląstelėse yra daug porų ir jonų kanalų. Kiekvienos ląstelės viduje ir išorėje atsiranda skirtingos jonų koncentracijos ar krūviai, kurie priklauso nuo ląstelės fiziologinės būklės. Dvipusis membranos lipidinis sluoksnis nėra pralaidus vanduo molekulės taip pat jonai. Nepaisant to, per krūvį vyksta dalelių mainai ląstelės membrana netaisyklingais intervalais. To priežastis yra jonų kanalų priklausomybė nuo įtampos. Pasiekus tam tikrą membranos potencialą, kanalai atidaromi pagal principą „viskas arba nieko“. Čia yra būtent pleistro spaustuko technika. Tokiu būdu matavimo pipetė perkeliama į jonų kanalą, neprasiskverbiant pro ląstelės membrana. Tokiu būdu galima tiksliai nustatyti vietinį elektrinį potencialą. Nuotėkio srovių, kurios gali turėti įtakos matavimo rezultatams, paprastai galima išvengti elektriniu būdu ypač sandariai sujungiant pipetės kraštą ir ląstelės membraną. Pleistrinio spaustuko metodas pagrįstas įtampos spaustuko technika. Šią techniką 1930 m. Sukūrė amerikiečių biofizikas Kennethas Stewartas Cole'as (1900–1984), kad matuotų nepažeistų nervinių ląstelių sroves. Įtampos spaustuke du elektrodai įterpiami į elementą, kad būtų suteikta komanda arba palaikymo įtampa. Tuo pačiu metu naudojamas kitas elektrodas, skirtas užfiksuoti sroves, kurios atsiranda per membraną. Jei neurofiziologai nori sužinoti apie elektros srovių srautą per tam tikras a nervinė ląstelė membrana, jie naudoja pleistro spaustuko techniką. Norėdami tai padaryti, jie naudoja smulkią stiklinę pipetę, kuri dedama į ląstelės išorę. Neigiamą slėgį galima sukurti jį nusiurbiant injekciniu švirkštu. Ši procedūra priverčia membraną šiek tiek išsipūsti atitinkamoje vietoje. Neigiamas slėgis užtikrina stiklo pritvirtinimą prie membranos. Dėl to pipete esanti maža membranos vieta elektriniu būdu izoliuojama nuo likusios membranos. Elektros srovėms matuoti neurofiziologai naudoja pleistro spaustuvo stiprintuvą. Tai yra specialus matavimo prietaisas. Idealiu atveju mokslininkas gali naudotis prietaisu gauti informaciją apie atskirų jonų kanalų elektrines savybes. Jonų kanalai reguliuoja, pavyzdžiui, įtekėjimą ir nutekėjimą natris jonai, kurie yra teigiamai įkrauti, nervų ląstelėse. Tyrimas atliekamas su žmonių, augalų ar gyvūnų ląstelėmis. Patch-clamp metodas paprastai atliekamas matavimo stotyje, kurioje yra įvairūs prietaisai. Ant vibracijos slopinto matavimo stalo yra vadinamasis Faradėjaus narvas, kuris tarnauja kaip elektrinis skydas. Be to, yra pleistro pipetės padėties nustatymo optinis mikroskopas su mikromanipuliatoriumi. Be to, pipetės laikiklis turi ryšį su išankstiniu stiprintuvu, o mėginio laikiklis prijungtas prie vonios elektrodo. Pleistrinio spaustuko stiprintuvas veikia stiprinant išankstinio stiprintuvo signalą. Taip pat yra monitorius, skirtas stebėti DUT ir pleistro pipetę. Daugeliu atvejų prie matavimo stalo taip pat yra kompiuteris ir keli duomenų saugojimo įrenginiai, kad būtų galima įrašyti skaitmeniniu būdu.
Rizika, šalutinis poveikis ir pavojai
Nėra jokios rizikos, susijusios su pleistro-spaustuko technika. Pavyzdžiui, žmonių, gyvūnų ar augalų ląstelės tiriamos tik jas pašalinus. Neribota prieiga prie išorinės ląstelės membranos egzistuoja retai. Dėl šios priežasties dažnai reikia paruošti ląsteles pleistro-spaustuko metodui. Užpildžius pleistro pipetę, ji užspaudžiama mikromanipuliatoriuje. Tai prijungiama prie pleistro spaustuko stiprintuvo ir švelniai prispaudžiama prie nepažeistos ląstelės. Procesą galima stebėti naudojant monitorių ar mikroskopą. Po pipete yra membranos gabalas, vadinamas membranos pleistru. Galutiniame pipetės gale sukurtas nedidelis neigiamas slėgis užtikrina tvirtą pipetės ir membranos ryšį. Šis procesas sukuria elektrinę varžą tarp išorinio tirpalo ir kelių gigahmų pipetės vidaus. Mokslininkai tai taip pat vadina „gigantiniu“, kuris leidžia pasiekti su ląstelėmis susijusią pleistro-spaustuko metodo konfigūraciją. Pleisto jonų kanalu tekanti srovė taip pat teka per pipetės turinį dėl didelio gigantinio pasipriešinimo. Prie stiprintuvo prijungtas elektrodas panardinamas į pipetės tirpalą, leidžiant išmatuoti atskirų jonų kanalų aktyvumą pleistro membranoje.
